L- Phe•(H₂O)₁

           L- Phe•(H₂O)₂

         L- Phe•(H₂O)₃

L- Phe•(H₂O)_1-3 (fenil alanin su) sisteminin öz salinimlarina örnekler; Simulasyonlar Prof. Tarakeshwar ( LasVegas Univ.,ABD) tarafindan Gaussian 98 kullanarak DFT metodu ile hesaplanmistir. Deneysel olarak frekanslar Prof. Brutschy grubunda (Frankfurt Univ., Almanya) moleküllerin süper sonik genislemelerinde IR/R2PI teknigi ile L- Phe•(H₂O)_1,2 kadar ölcülmüstür.   

         Cok genis anlamiyla spektroskopi madde ile elektromanyetik dalgalarin etkilesimini inceleyen bir tekniktir. Maddeyi burada elemanlari atom alti parcaciklardan baslayan ve kara cisimlere kadar uzana evrensel bir küme olarak ele aliyoruz. Bu yüzden spektroskopi temel bilimlerde cok genis bir alan kaplar. Genis alan kaplamasi inceleme alaninin mikroskopik dogadan baslayip makroskopik dogaya kadar genisletilmesinden degildir sadece. Kullanilan isik kaynaginin niteliginden, dalga boyundan, incelenen maddenin hangi fazda olmasindan baslayarak, hangi özgürlük durumunun uyarilacagina kadar uzanan bir alanida icerir ayrica. Biz burada konuyu kisitlamak icin laser spektroskopisi ile sinirli kalacagiz. Dahasi sadece moleküler spektroskopisi ile ilgilenip, R2PI(iki fotonla resonant iyonlastirma), IR/ R2PI  ( kizil ötesi taramali, resonant cifte fotonlu iyonlasma), UV-UV( hole burn spectroscopy), LIF( laser zorlamali floresans), MATI(Mass Analyzed Threshold Ionization), ZEKE(ZEro Kinetic Energy), Cavity-ring-down-spektroskopisi gibi modern spektroskopik yöntemleri inceleyip, en son olarakta bir molekülün bir tür konformasyonunun, nasil bir baska konformasyona kizil (IR) ötesi isinlarla dönüstürülebilecegini tartisacagiz. Ama herseyden önce temel dayanak noktamiz kütlenin ölcülmesi teknigi olan kütle spektroskopisine giris yapacagiz.

Bir Moleküler Terazi Teknigi: Kütle Spektrometresi

Bu bölümde dogrusal ve dogrusal olmayan kütle spektrometreleri nitel ve nicel olarak incelenecektir. Kütle ölcümünde yöntem, elektrik ya da manyetik alanda yüklü parcaciklarin hizlandirilmasidir. Eger manyetik alanla calisiyorsak parcaciklarin yörüngelerindeki egriligin belirlenmesi, elektrik alanla calisiyorsak parcaciklarin bir dedektöre ulasana kadar ucus sürelerinin ölcülmesi bize kütleler hakkinda bilgi verir.  Ilkin dogrusal kütle spektrometresini aciklamakla ise baslayalim ve figür 1 deki düzenegi kuralim. Bu düzenek birbirine paralel ve birbirinden U₁ potansiyel farki olan, arlarinda l₁ uzakligi bulunan R (repeller) ve A (accelerator) elektrotlarindan olussun. A elektrodunun arkasinda ve ona l₂ uzaklinginda yine A'ya paralel nikel ya da altindan, sifir potansielde (U₃=0) tutulan, sekilde kesikli cizgilerle gösterildigi gibi bir ag gerilmis olsun. Ayrica A elektrodunun ortasi delikli olup, bu deliginde altindan bir ag ile kapli oldugunu varsayalim. Son olarak altin agin l₃ uzakligina dedektörümüzü yerlestirelim. Burada unutulmamasi gereken sey bütün bu düzenegin paslanmaz bir celik tüp icerisinde bulunmasi ve tüpün yüksek vakumda  (10^-6 mbar) tutulmasidir. Yüksek vakumda calismamizin iki nedeni var; birincisi tüpün icerisinde ölcmek istedigimiz moleküllerden baska molekülün bulunmasi durumunda, ölcüm sonucu elde edilen spektrumlarda bu istenmeyen moleküller parazit spektrum olarak ortaya cikar ve kütlelerin belirlenmesi zorlasir. Ayrica bu yabanci moleküllerin ölcmek istedigimiz moleküllerle kimyasal reaksiyona girmeyecegini garanti edemeyiz. Diger neden ise elektronikten kaynaklanir; öyleki R ve A elekrotlari biribirine yaklasik 5cm uzakta bulunup yüksek voltajda tutulurlar ve vakum kalitesinde düsüs iki elektrodu birbirine kisa devre yapacak sekilde baglar, eger arada iyonlasmis moleküller varsa, kisa devre daha hizli gerceklesir ve sonunda tüm labaratuvar devre disi kalabilir, dahasi vakum kalitesindeki düsüs dedektörüde doyum noktasina ulastiracagi icin ölcüm yapmak olanaksizlasir. Celik tüp icinde elektrodlardan, altin agdan ve dedektörden olussan yüksek vakum icindeki sistemimize geri dönelim. Burada R ve A arasindaki bölgeyi ionlasma bölgesi olarak adlandiralim. Kütlelerini ölcmek istedigimiz molekülleri, capi 1-2mm olan bir delikten ( kolimatörden) gecirerek iyonlasma bölgesine püskürtelim ve burada pulslu (zamansal uzunlugug 10-15ns) calisan bir UV-laseri ile molekülleri iyonlastiralim. Artik elektronlarini yitiren moleküller positif yüklüdürler ve kendileri gibi pozitif yüklü R elektrodu tarafndan dedektör yönüne dogru yönlendirilirler. Önce sistemi basitte indirgeyerek inceleyelim ve A elektrodunun olmadigini varsayalim. Postif yüklü iyonlar R elektrodunun itici potansiyeli icinde hizlanarak dedektöre dogru ilerleyeceklerdir ve sonuda dedektörün cekici potansiyeline kapilip dedektör tarafindan sogrulacaklardir¹. Burada t₀ 'i laser pulsunun laserden salindigi an (bu bir fotodiyotla ölcülebilir) ve t₁'i iyonlarin dedektöre ulastigi an olarak kabul edersek, ucus süresi t₁-t₀ olacaktir².

Figür1: Wiley ve Mclaren prensibine göre düzenlenmis lineer kütle spektrometresi. Iyonlarin bir araya geldikleri yer ayni zamanda dedektörün bulundugu konumdur. Burasi konumsal odak noktasi olark tanimlanir.( Ayrintilar konu icindedir)

Bütün moleküller dedektöre ulasana kadar hemen hemen ayni yolu kat ederler. Bu yüzden kinetik enerji formülünde yol degiskeni cekilerek, ucus süresi ile kütle arasinda oranti kurlarak kütleler belirlenir³. Gercekte ucus süresi ölcülerek kütleye ulasildigi icin bu tür spektrometrelere ucus zamani ölcen kütle spektrometreleri denir (TOF, Time of Flight). Simdiye kadar bos uzayda yüklü parcaciklari elektrik alanda hizlandirdik ve sonunda bir dedektöre carptirarak parcaciklarin ucus zamanlarini ölctük. Agir olan parcaciklarin hafiflere göre dedektöre daha gec gelecegi prensibinden yararlanarak bir kütle spektrometresi kurmus olduk. Buraya kadar iyi, ancak tasarladigimiz spektrometrenin cözünürlügünün ne oldugu hakkinda daha bir fikrimiz yok. Tasarlanan spektrometre öyle olmali ki, iyonlasma bölgesi icinde farkli dogum yerleri olan ayni tür molekülün iyonlari dedektöre ayni anda ulasabilmeliler. Ayni molekül türünün iyonlari, dogum yerlerinin farkili olmasindan dolayi dedektöre farkli zamanlarda gelmeleri halinde, ayni kütleye sahib molekülleri farkli kütleye sahibmis gibi ölcecegimiz kesindir. Bu sorun, baslangicta biz molekülleri iyonlasma bölgesine püskürtürken olustu. Bütün molekülleri ayni noktaya odaklayabilecek bir püskürtücü sistemde olamayacagina göre, iyonlarin dogum yerlerinin bir dagilim gösterecegi mutlaktir. Yeri gelmisken belirtelim, dogum yeri farkliligi ayni zamanda iyonlastirici laser isininin bellirli bir yari capa sahip olmasindan da kaynaklanir, her ne kadar toplayici mercekte kullansak bu sorunda giderilemez. Buraya kadar kötü. Ayni kütleye sahip molekülleri farkli kütleye sahipmis gibi ölcüyorsam, tasarlanan spektrometre bosa gitmistir ve bizde zamanimizi bosa harcadik dersek yanilmis oluruz. Wiley ve McLaren[1] iki alan adini verdikleri düzenekle, yani sisteme A elektrodunu katarak, dogum yeri daglimindan dogan ucus zamani farkliligini gidermisler, dolayisila spektrometrenin cözünürlülügünü artirmislardir. Nasil mi? Dogum yerleri farkli a,b,c iyonlari ayni tür molekülün iyonlari olsun. a,b,c iyonlarinin hepsi R' nin A'ya göre baskin itici potansiyelini hissedecekler, ancak a iyonu digerlerine göre R'ye daha yakin oldugu icin digerlerinden dahada R'nin itici potansiyelini hissedecektir. Böylece en geride olan a iyonu digerlerine göre daha hizli hareket edecek ve A'nin itici potansiyeli icinden gecip gidecektir. Bu olay gerceklesirken b, ve c A'ya daha yakin olduklari icin coktan dedektör tarfina gecmislerdir. Bundan sonra R ve A ya ugulanan potansiyel farkina bagli olarak öyle bir konum bulunur ki, burada bütün iyonlar ayni konumdadirlar. Böylece sisteme A elektrodunu katmakla konumsal bir odak bulunmus oldu. Kisa bir deneme süresi ile, yani R ve A'nin potansiyelleri degistirilerek bu odak noktasi dedektör üzerine düsürülebilir.Böylece dogum yeri dagilimdan kaynaklanan hata giderilmis olur ve ayni kütleye sahip iyonlarin ucus süreleri dogum yeri farkliligdan bagimsizlasir. Bu ucus süresinin s'ye göre birinci türevinin yok olmasi demektir. Denklem (1) bunu isaret eder.

burada t_f,  (2)'nci esitlikte yazildigi gibi toplam ucus süresini verir. Bu, örnek olarak b iyonunun dedektöre ulasmasi icin bütün araliklarda harcadigi ucus zamanlarinin toplamindan olusur.

Böylece en temel bir veriye ulasmis olduk, yani ucus süresini s'den bagimsizlastirdik. Bundan sonra elektrostatigin ve mekanigin denklemleri ile ucus süresi icin bir acik ifade türetebiliriz. Denklem (3)'te her bölge icin potansiyeller ve iyonlarin bu bölgelere ilk giris hizlari yazilmistir. Burada U, b iyonunun bulundugu konumdaki elektriksel potansiyel, v₀ iyonun l₂ bölgesine giris hiz , v₃ 'te yine iyonun l₃ bölgesine ilk giris hizidir.

Bu denklemlerden her bölge icin ucus süreleri cekilip ve toplam ucus süresinde yerine yazilirsa, asagidaki (4) toplam ucus esitligine ulasilir.

Simdi parametrik olarak odak noktasini belirlemek icin denklem (4)'ü denklem (1)' de yerine yazarsak asagidaki sonuca ulasiriz:

Denklem (5), elektrodlarin yerlerinin sabit tutulmasi sarti ile A ve R' nin potansiyellerinin variasyonu ile konumsal odagin belirlenebileceginin recetesidir. Bir örnek olarak, Wiley ve Mclaren iki alan düzenegi ile kütlesi 106 amu olan bir molekülün kütle cözücülügü R=m/Δm=900'e kadar cikarilmistir. Simdi tek alan düzenegine geri dönelim ve denklem (5)'te l₂ ve U₂ yerine sifir yazalim. Böylece tek alan düzenegi icin de l₃=2s'de konumsal odak bulmus oluruz. Ancak s en fazla iki elektrot arasindaki uzakligi alabilecegi icin, l₃' de bu durumda cok kisa bir uzakligi ifade eder. Tek alan düzenegi ile yine 106 amu kütlesi icin R=m/Δm=100 gibi bir kütle cözücülügü elde edilmistir. Görüldügü gibi Wiley ve Mclaren iki alan düzenegi ile, tek alan düzenegine göre kütlesi 106 olan bir molekül icin belirli deney sartlarinda 9 kat daha iyi kütle cözücülügüne ulasilmistir. Bir birine cok yakin kütleye sahip olan iki molekülün kütlelerinin spektrumda birbirnden bariz ayirt edilebilir olmasi spektrometrelerin cözücülügün yeterli olmasini gerektirir. Wiley ve Mclaren düzenegi cözücülügü iyilestirmede önemli bir adimdir. Ancak atilmasi gereken daha adimlar vardir. Baslangicta iyonlastirici UV laser pulsunun zamansal uzunlugunu 10-15 ns olarak verdik. Simdi, pulsun icine yeteri derecede foton hapsedilmisse ve pulsun son anlari da baslagic ani gibi molekülleri iyonlastirabilme yetenegine sahipse, 10-15 ns aralikta ayni tür molekülün iyonlari doguyor ve yine bu zaman farki ile dedektöre ulasiyorlar demektir. Bu sorun konumsal odaklamadan sonra birde zamansal odaklama yapilmasini gerektirir. Degisik hapsetme yöntemleri ile bu sorun asilabilir, örnegin pulsun baslangic aninda iyonlasan moleküller, pulsun bitis aninda iyonlasan moleküllerle bulusana kadar iyonlasma bölgesinde bir cesit ion optigi ile hapsedilirler. Zamansal odaklama saglamanin en iyi yöntemlerinden birsi de kisa zaman laseri (fs-laser) kullanilmasi olacaktir. Böylece dogum tarihindeki dagilim ortadan kaldirilir ve daha iyi cözücülük elde edilir. Buraya kadar kütle spektrometrelerinde degisik etkenlerin neden oldugu, ayni tür molleküllerin iyonlarinin dogum yeri ve dogum tarihleri üzerinde düzeltmeler yapmak zorunda kaldik. Ancak iyi bir ölcüm icin böyle bir spektrometre daha olugunluga erismemistir. Baslangicta iyonlasma bölgesine mollekülleri belirli bir hizla püskürttük ve püskürtücünün püskürtme deliginden cikan moleküllerin bir hiz dagliminda olacagi kesindir. Böylece iyonlasma bölgesinde hem dedektör yönünde hem de dedektöre zit yönde hiz bilesenleri olan ayni kütleli moleküller bulunacaktir. Basalangictan beri var olan bu durum zaman ve ya konum odaklanmasi ile giderilemez, öyleki iyonlar daha dogmadan farkli kinetik enerjilere sahiptirler. Her ne kadar Wiley ve McLaren düzenegi ile konumsal odaklanma saglansa bile bellirli bir zaman sonra, iyonlar baslangic enerji farkliligindan dolayi yine birbirinden ayrilacaklardir. Böylece simdiye kadar yapilan odaklanmalara birde enerji odaklanmasi eklenmelidir. Bu sorunun nasil giderilecegini ilk kez gören Mamyrin ve arkadaslari olmustur[2].

figür2:RE-TOF-MS (Reflektron-Time-Of-Flight-Mass-Spectrometer) Wiley ve McLaren ve ayni zamanda Mamyrin düzenekli ucus zaman ölcer liner olmayan kütle spektrometresi.

Bir ucus zamani ölcen kütle spektrometresi ne kadar uzunsa yani iyonlar ne kadar cok ucarlarsa, spekrometre o kadar iyi cözücüdür. Bu yüzden spektrometreler oldukca uzun yapilmaya calisilir. Ancak uzunlugunda getirdigi bir sorun vardir, bu da konumsal odak noktasinda bulusan iyonlarin bundan sonra yine biri birinden ayrilmasidir. Bu ayrilma yukarda degindigimiz gibi ilk hiz farkliligindan kaynaklanir. Iyonlari yeniden birlestirmek ve ucus sürelerini ayni tutmak icin figür 2 deki yansitilici lineer olmayan TOF sistemi kurulur. Yansiticilar( Reflektör) bir birine paralel elektrodlardan olusur. Bu elektrodlar iyonlarin gelis eksenine belirli bir aci yapacak sekilde monte edilmislerdir. Ayrica önden baslayarak arkaya kadar her ardisik iki elktrod arasinda direnc lehimlenerek, sabit gradiyentli bir potansiyel düsüsü saglanir. Diger elektrodlar gibi yansiticilarda positif potansiyelde tutulurlar. Konumsal odaktan ilk ayrilan iyon digerlerinden daha enerjili oldugu icin reflektronlarin icine, diger az enerjili iyonlara göre, daha derinleri girer. Iyonlar reflektron icinde sürekli frenlenerek, belirli derinlikte enerjilerini tamamen kaybederler ve sonunda itici potansiyelle gelis eksenine göre belirli bir acida bulunan dedektöre dogru yansitilirlar. Enerjileri düsük olan iyonlar, enerjileri yüksek olanlara göre reflektör icinde daha derinlere ulasamazlar ve enerjilerini yitirip, daha erken dedektöre yansitilirlar. Böylece cok enerjili gec yansitilan iyonlarla, az enerjili erken yansitilan iyonlar yine reflektör disinda bulusurlar. Bu bulusma noktasi dedektörün konumlandigi yer olup yine tüm elktrodlarin potansiyeline baglidir. Bu nokta enerji odaklanmasi olarak anilir. Iyi bir ölcüm yapilabilmesi icin söz konusu elktrodlarin potansiyeller sistematik degistirilmelidir. Böylece konunun sonuna geldik. Bu bölümde ucus zamanli kütle spektrometrelerini tanidik, dahasi kütle cözücülügünü artirmak icin Wiley ve McLaren ve ayni zamanda Mamyrin düzenegini tartistik. Konum, enerji ve zaman odaklanmasi konularini inceledik. Sistemin elektronigi ve yazilimini bir yere birakirsak, geriye sadece dedektör donaniminin anlatilmasi kaliyor. Yaygin sekilde kulanilan dedektörlere örnek olarak MCP'yi verebiliriz (Micro Chanel Plates). Bu dedektörler mikro kanallari olan silisyum levhalarindan olusur. Kanallar etkilesim alanini (tesir kesitini) artirmak icin iyonlarin gelis yönüne göre 8° egimlidirler. MCP'lere sayet sekiz derece egimli bir aci ile bakilirsa saydam bir levaha gibi davraniralar. Calisma prensibi ikincil elekron cogalticilari (SEV) gibidir. MCP kanali icine carpan yüklü parcaciklar, kanalin ceperinden elektron sökerler, sökülen bu elektonlar kanali terk edene kadar kanalin duvarlarindan elektron sök söke yollarina devam ederler. Sonucta cig seklinde elektron cogalmasi olur, birinci MCP'nin karsisina ve ona paralel ikinci bir MCP yerlestirilirse (Chevron düzenegi) katlamali olarak elektron artisi gözlenir ve bu elektronlar sonunda simsek seklinde bir anoda carparak bir potansiyel gradiyenti olustururlar bu da iyonlarin ucus sürelerinin bittigi anlamina gelir. Figür 3 böylesi bir düzenegin semasini göstermektedir.

figür3: Chevron düzenegi: Karsilili bir birne paralel yerlestirilmis MCP: Burada her bir MCP'nin elektron artirimi 10 ⁴ basmaginda olup bu katlanma uygulanan potansieyele baglidir.

Iyon optigi, hizlandirici potansiyeller ve calisma ilkesine bakilirsa kütle spektrometreler televizyon, osiloskop, TEM( trans elektron mikroskop), REM( taramali elektron mikroskop), proton- elektron hizlandiricilari gibi aletlere benzerdir.

1. Spektrometrenin ekseni boyunca ilerleyen iyonlarin dagilmamalari icin adina iyon optigi denilen ek elektrik ya da manyeti alanlar uygulanir. Bu alanlar sekilde gösterilmemistir.

2. Dikkat edilmesi gereke sey bu sürenin( t₁-t₀) mutlak olmamasidir, yani laser pulsunun iyonlasma yerine gelene kadarki gecen süreyide kapsiyor olmasidir. Dolayisi ile ölcülen ucus süresinden L/c cikrailirsa, mutlak ucus süresi bulunmus olur, burada laser isinlarinin cikis noktasi ile iyonlasmanin gerceklestigi uzakligi L ile gösteriyoruz ve c de isik hizidir).

3. Baslangicta belirli potansiyeller altinda ve kütlesi bilinen bir parcacik ölcülerek, spektrometre kalibre edilir.

R2PI-Spektroskopisi

 Moleküllerin spektrumlarinda gözlemlenen gecisler atomlara göre cok daha fazladir. Bunun nedeni moleküllerin atomlara göre daha fazla ic özgürlük derecelerine sahip olmalaridir. Isin icine ötelemeyide katarsak moleküller genelde elektronik, vibrasyon, rotasyon ve translasyon olmak üzere dört özgürlük derercelidirler. Ancak translasyon sevyeleri kuantumlanmadigi icin bunu göz ardi edecegiz. Bir molekülün belirli kuantum sevyelerinin elektronla doldurulmalari olayina molekülün uyarilmasi adini veriyoruz. Söz konusu uyarilan kuantum sevyesi bir vibrasyon sevyesi ise molekülün o sevyedeki titresimlerini gözlemleriz. Böylesi uyarilmis moleküllere ''sicak moleküller'' denir ve spektroskopik ölcümler icin iyi bir aday olmazlar. Oda sicakliginda bir molekül toplulugunun temel elektronik durumda, vibrasyon sevyeleri degil ama, rotasyon sevyelerinin uyarildigini bilmeliyiz. Disardan bir enerji paketi ile bu moleküller elektronik gecis yapmalari icin zorlanirsalar, spektrumda birden daha cok ve bir biri üzerine düsmüs, secilemeyen gecis frekanslari gözlenir. Bu olay gönderdigmiz enerji paketinin, elektronik temel durumda ve farkili rotasyon sevyelerinde bulunan elektronlari bir üst sevyeye cikarmasindan kaynaklanir. Burada hemen belirtelim, her elektronik seviyeye sayisiz vibrasyon ve her vibrasyon sevyesine de sayisiz rotasyon sevyesi eslik eder, figür 4 de bu gösterilmistir.

figür4: Bir molekülle ait enerji semasi: n elektronik, v vibrasyon ve j rotasyon kuantum sayilaridir. Oda sicakliginda farkli moleküller farkli rotasyon sevyelerinde bulunurlar. Moleküller bir üst elektronik sevyeye gecereken  bu farkli sevyelerden gecis yapacaklari icin spektrumlar yeteri derece cözünürlüge sahib degillerdir. Sicak moleküllerden kast edilen budur.

Bir örnek vercek olursak HCl molekülünde ardisik ilk iki vibrasyon sevyesinin enerji farki 2900cm^-1 ve ilk iki rotasyon sevyesi arasindaki fark 21 cm^-1 dir. Oda sicakligini dalga sayisi cinsinden 209cm^-1 olup ve bu degerleri Boltzmann dagiliminda yerlerine yazarsak;

 moleküllerin dagilim(olasiliklar) hakkinda bilgi edimis oluruz. Burada görüldügü gibi rotasyonel uyarilmis ilk sevye n₁=1  hemen hemen temel sevye olan n₀=0 ile ayni olasilikta ilk uyarilmistir. Vibrasyon sevyeleri icin bu durum farklidir, bir molekülün oda sicikaliginda ilk vibrasyon sevyesinde bulunmasi olasiligi temel sevyeye göre 10 milyonda birdir, bu da HCl molekülünün oda sicakliginda vibrasyonel uyarilmadigini gösterir (Burada girilebilir durumlar hesaplanirken dejenerelik göz önünde bulundurulmamistir). HCl göre daha büyük moleküllerde durum farkli degildir. Ancak isin icine daha cok atom katildigi icin rotasyon sevyeleri daha da cok artar ve siklasir, böylece oda sicakliginda moleküler tamamen uyarilmis durumdadirlar. Bu durum spektrumlari daha da anlasilmaz hale sokar. Öyleyse uyarilmamis durumdaki rotasyonel sevyelerin bosaltilmasi gerekir, bu da moleküllerin sogutulmasindan gecer. Soguk molekül elde etmenin bir yöntemi yüksek basinc kabininden molekülleri capi bir kac yüz mikrometre olan bir delikten yüksek vakum odasina genisletmektir[3,4,5,6]. Bu genisletme genellikle He, Ne, Xe gibi asal gazlarla yapilir, böylece moleküller vakumda bir kac kat ses hizina ulasirlar. Buna moleküllerin jet ya da supersonic genislemesi denir. Moleküller ses hizina ulasmadan hemen önce, kendi aralarinda ve asal gaz atomlari ile ikili ve ya üclü carpisma yaparlar. Bu carpismalar sonucu sicak olan moleküller fazlalik ic enerjilerini asal gazlara aktarirlar. Tek atomlu asal gazlarin ic özgürlük dereceleri olmadigi icin, bu aktarilan enerjiler dogrudan kinetik enerjiye dönüsür. Moleküllerden ve asal gazlardan olusan sistem böylece ses hizina ulasarak asiri sogmaya ugrarlar (10-30K).  Bu soguma ic özgürlük dercelerin donmasi anlamina gelir ve moleküller böylece vibrasyonsuz, rotasyonsuz elektronik temel sevyede bulunurlar. Ic özgürlük derecelerin donmasi sadece spektoskopiyi kollaylasitirmaz, ayni zamanda moleküller homojen ya da heterojen kimyasal olmayan baglarla adina Cluster denilen yapilarda bulunurlar. Sogutma ne kadar etkinse bag kuran molekül sayisida o kadar cok olur. Bu sekilde  manipüle edilmis molekülleri ölcmek, onlarin pertürbasyonu sifir olan durumlarindan bilgi edinmek demektir. Buraya kadar molekülleri sogutmakla, onalarin uyarilmamis en temel kuantum sevyesine inmelerini sagladik. Artik degisik spektroskopik yöntemler uygulayarak, molekülerin geometrik yapilarini, enerji sevyelerini, salinim frekanslarini dolayisi ile bag enerjilerini, farkli sevyelerinin yasama ömürlerini ölce biliriz. Bu ölcüm teknilerinden birisi R2PI yöntemidir. Rezonant iki foton sogurmasi teknigi olan R2PI-spektroskopisinde soguk moleküller ayni anda iki UV- fotonu (mor ötesi) sogurarak iyonlasirlar. Her iki fotonun ayni kaynaktan gelmesi durumuna, yani uyarici fotonun enerjisi ile iyonlastirici fotonun enerjisi ayni ise (1C-R2PI) tek renkli iki foton soguramsi denir. Her iki fotonunda ayri kaynaklardan gelmesi (2C-R2PI) tekniginde fotonlar farkli enerjilere sahiptir. 1C-R2PI spektroskopisinin uygulamsi kolay olmasina ragmen, her zaman fragmentasyonsuz ölcüm yapilamaz, bu durum teknik olarak gerceklestirilmesi zor olan 2C-R2PI spektroskopisinde öyle degildir. Birinci renge eklenen ikinci rengin enerjisi kolaylikla degistirilebilecegi icin fragmentasyonsuz ölcüm yapilabilir. Figür 5 sematik olarak iki teknigide göstermektedir.

 figür5: 1C-R2PI ve 2C-R2PI -spektroskopisi; esit enerjili iki fotonla iyonlastirma, tarama sürecinde iki fotonun enrjisi ayni ölcüde degistirilir. Burada  1 orjin gecisidir(0-0). Bu gecisler genligi en siddetli gecislerdir genellikle ( aykiri durumlarda vardir, bu molekülün uyarilirken geometrilerinde cok büyük degisiklik olup olmamasi ile ilgilidir),solda.  2 renkli iyonlastirmalarda ikinci fotonun enerjisi ΔE(IP-S₁) araligindan fazla büyük olmayacak sekilde taranir. Bu sevyeye gelene kadar iyonlasma sifirdir, ilk iyon sinyali ΔE sifirdan cok az büyük oldugu durumlarda gözlenir ve iyon genliginde basamak seklinde artis gözlenir ( alttaki enerji diyagrami), sagda.

1C-R2PI iyonlastirma tekniginde görüldügü gibi her iki okun rengide ( boylari) aynidir, dolaysi ile iki fotonda ayni enerjiye sahiptir. Bir fotonun enerjisi digerinden bagimsiz degistirilemez, öyleki iki foton da ayni laserin ayni pulsundan türemistir. hν₁> IP-E(S₁) olmasi durumunda, fazlalik olan δE=hν₁-IP-E(S₁) enerjisi sistemin ic enerji olarak depolanir ve clusterin fragmentasyonuna neden olabilir (van der Waals fragmentasyonu). Baska bir relaksasyon kanali ise bu fazlalik enerjinin molekülden sökülen elektronda kintik enerji olarak kendini göstermesidir. Foto elektron (PES) ya da PEPICO (photo elektron photoion coincidence)  spektroskopisi gibi tekniklerle bu enerjiler ölcüle bilir ve elektronun hangi orjinden geldigi hakkinda bilgi edinilebilir. 2C-R2PI tekniginde sisteme eklenen ikinci foton birincisine göre daha kirmisidir. Böyle olmasida gerekir. Bu teknikle yapilmak istenilen, fazlalik enerjiyi δE=hν₂-IP-E(S₁) en az seviyeye indirmektir. Iki renkli iki foton sogurma yönteminin bir avantaji da, uyarilmis durumlarin yasam sürelerini ölcme teknigi olmasidir. Ilkin ilk fotonun enerjisi ΔE(S₁-S₀) ( vibrasyonsuz bu tür gecisler ayni zamanda 0-0 gecisleride denir) araligina resonant ayarlanir sonra ΔE(IP-S₁ ) enerji araligi ikinci fotonun enerjisi degistirilerk taranir. Bu sürec iyon sinyali gözlemlenene kadar sürdürülür. Ilk iyon gözlmelendiginde, ikinci fotonun enerjisi artik degistirilmez (δE~0 olmustur).  Sanki burada ikinci fotonda IP-S₁ araligina resonant yerlesmis gibidir. Böylece molekülün iyonlasma enerjisi, iki fotonun toplam enerjisi olarak bulunmus olur. Iyonlasma enerjisi bulunduktan sonra, ilk fotonla moleküller yine uyarilir. Ikinci foton sifir dan baslayarak bir dt araligi ile ötelettirilerek sisteme baglanir. Belirli bir zaman araligindan sonra iyon sinyalleri kayibolur,böylece t=0 anindan iyon sinyallerinin kaybolmasi icin gecen zaman araligina molekülün uyarilmis durumunun yasam süresi denir. Burada bilinmesi gereken, laserler taramalidir yani, ölcüm süresince dalga boylari degistirilebilirdir. Bir molekülün elektronik sevyelerinin enerjileri bilinmedigi icin, kirmiz bölgeden baslanarak mavi bölgeye kadar enerji taramasi yapilir. Böylece ilk foton rezonant bir gecis yakalarsa, bu gecisler spektrumda bir frekans bandi olarak gözlenir. R2PI spektrumlarda 0-0 elektronik gecisler en siddetli gecisler olup ( cogu kez), bu bandlar diger gecislere göre kirmizi bölgede bulunurlar. Sayet spektrumda bu gecisten daha kirmizi bölgede gecise rastlanirsa, bu dimer, trimer yapilarin gecisleri olarak yorumlanmalidir. Simdi, bunu bir örnekle acilamadan önce, ideal bir R2PI ölcümü elde etmek icin, ölcüm sisteminin nasil olmasi gerktigini kisaca aciklayalim. Her seyden önce laserler ve molekül püskürtücüleri pulslu calismalidir (Pulsu calisan laserler daha etkin lineer olmayan optiksel davranislara neden olurlar).     Moleküllerin ic özgürlük dercelerinin etkin donmasi, onlari asal gazlarla vakuma pulsu püskürtmekten gecer. Iyon sinyallerinin istenilen genlikte gözlene bilmesi icin, yeteri sayida molekülün yeterli sayida fotonla bulusmasi gerekir. Bir baska deyisle laser pulsunun icinde yeterli dercede foton, molekül pulsunun icinde yeterli dercede molekül bulunmalidir. Ve bu iki puls etkin bir sekilde carpismalidirlar. Etkin carpisma, bir pulsun var olusu zamani icinde diger pulsla ayni konumda bulusmasidir. Baska bir önemli konuda pulsun icindeki fotonlarin veya moleküllerin zamansal olarak bir dagilim düzensizligi olusturmamalaridir. Böylece bu sartlar yerine getrildigi ölcüde, yinelene bilir ölcümler yapilabilir, bu bilimin evrensel ilkesidir. Simdi bir örnek verelim.

figür 6: Fenol/ Amonyak sisteminin kütle spektrumu. Sistem He ile vakuma püskürtülmüs ve (1:1) sisteminin rezonans enerjisi olan 35712 cm^-1 dalga sayisinda kaydedilmistir. Burada (1:n) notasyonuda birinci bilesen fenol sayisini, ikinci bilesen amonyak sayisini verir. Örnek olarak (1:6), bir fenol ile 6 tane amonyak molekülünün hidrojen köprü bagi yapmis oldugunu anlatir.

Daha önce belirtigimiz gibi kütle spektroskopisi R2PI spektroskopisinin bazini olusturur. Simdi, fenol/ amonyak sisteminde istenilen büyüklükteki (1:n) kütlesi üzerine bir ölcüm penceresi konulup, R2PI spektrumu, yani ultraviyole taramasi yapilirsa, figür 7'deki spektrumlar elde edilir. Figür 7a monomer kanalinin, figür 7b hetro dimer kanalinin (bir fenol bir amonyak hidrojen köprü bagi) R2PI spektrumlaridir. Burada 1 ile gösterilen bandlar 0-0 (uyarilmamis temel elktronik sevye ile uyarilmamis ilk elektronik seviye gecisleri,S₁-S₀), diger 2,3,4,5 ile gösterilen bandlar birinci uyarilmis elektronik seviyedeki vibrasyon sevyeleridir, yani  S₀→S₁(ν,j>0) gecisleridir. Görüldügü gibi UV-taramsida rezonant gecisler spektrumda bir band olarak kendini göstermektedir. Bandlarin disinda iyon genlikleri sifirdir. Bu araliklarda da sisteme enerji gönderilmektedir ancak, bir absorpsiyon söz konusu degildir. Kuatum mekaniginden bilinen gercek burada kendisini carpici sekilde göstermektedir, disarda enerji bulunmasina ragmen, sistem ancak kesikli ve ayrik enerjileri kabul etmektedir. Iyi bir R2PI bandinin genisligi 5-10 cm^-1civarinda olmalidir. Daha genis bandlar gözlenmesi durumunda moleküllerin yeteri derecede sogu olmadiklari kanisina varilir, zaten spektrumda da cluster yapilari gözlenemez. Sicak moleküllerde (0-0) gecislerinin kirmizi bölgesinde sirtlar olusur, bu acikca temel elektronik (S₀) durumda rotasyon seviyelerinin uyarildigini gösterir. 

figür 7: (1:0)⁺ ve (1:1)⁺ fenol/amonyak sisteminin R2PI-spektrumlari. Burada 1 gecisleri vibrasyonsuz elektronik gecislerdir. 2,3,4,5 gecisleri birinci elektronik seviyede (S₁) vibrasyon seviyeleridir.

Bir baska deyisle, kisaca R2PI teknigini moleküler bir sistemin enerji özdegerleri hakkinda bilgi edinme yöntemidir. Bu yöntem  kütleye dayali spektral dagilim elde etme spektroskopisi oldugu icin iki boyutlu spektroskopi yöntemidir.  

IR/R2PI ve UV-UV Ion Azaltma Spektroskopisi

 Yapilarinda bir ya da birden fazla kovalent tek bag bulunduran moleküller, ic özgürlük durumlarinin farkli populasyonu sonucu (belirli bir sicaklikta) farkli konformasyonda bulunurlar. Burada konformasyondan anlasilmasi gereken sey, bir molekülün farkli geometrik yönelimleridir. Farkli geometrik yapi olan konformasyonda cekirdeklerin ve elektronlarin birbirine olan uzakliklari da diger konformsyonlara göre farklidir. Bu yüzden her konformasyonun toplam potansiyel enerjisi bir birinden farklidir. Bu farklilik spektrumlarda kendisini gösterir ve her konformasyonun kendine ait, parmak izi (finger print) gibi biricik spektrumlari gözlenir. Belirli bir konformasyon cok soguk durumda yasamaya bilir, bir baska yapi ise dominant olarak gözlemlenebilir. Vakumda (bos uzayda) genisleyen süper sonik bir molekül pulsunun icinde yukarda sözü edilen ayni molekülün farkli konfermasyonlari birarada yasarlar. Bu durumda R2PI spektrumu alinirsa, spektrumun cok sayida gecis bandlarindan olusacagi, her konformasyonun gecis bandalarinin bir spektrumda üst üste gelecegi kesindir.  Bir baska anlatisla, konformasyon sayisi kadar R2PI spektrumu bir spektrumda üst üste gelecektir. Ayni molekülün farkli konformasyonlarindan bahsettigimiz icin, kütleni diskriminatör olma özeligi kalmamistir. Öyleki puls icinde sadece bir tür molekül bulunmaktadir ve hepsinin kütlesi aynidir. Bir öncek konuda gördügümüz gibi, bir R2PI spektrumda elektronik gecislerin yani sira vibronik gecisler de gözlenir. Coklu konformasyonlarin bulundugu ölcümlerde hangi bandlarin biribirine ait olduklari, ya da hangi band kümelerinin bir konformasyonun gecisleri oldugunu belirlemek sadece R2PI spektroskopisi ile zordur ( ancak molekül pulsunun farkli konumlari, yani farkli sicakliktaki bölgelerinde ölcümler yapilirsa, ayni orjine ait bandlarin iyon genliklerinde ayni ölcüde azalma ya da artma görülür,  buna ragmen bu yöntem saglikli degildir). Bu zorlugu ortadan kaldiran iki yöntem IR/R2PI ve UV-UV iyon azaltma spektroskopi teknikleridir.

 figür 8: R2PI-spektrumlarinda gecis bandlarinin siniflandirma yöntemleri arasinda en yaygin kullanilan iki teknik: IR / R2PI ve UV / UV yöntemidir.

Sematik olarak iki yöntem figür 8 de gösterilmistir. Her iki yöntemde de ilkin UV isinlari ile sabit iyon genligi elde edilir. Sisteme, UV isinlarindan dt zaman önce taramli bir kizil ötesi isin gönderilirse, kizil ötesinin her uyardigi rezonant vibrasyon sevyesi gecisleri temel durumun bosaltilmasi demektir. Böylece dt zaman sonra gelen UV laser pulslari temel sevyede önce uyaracak sonrada iyonlastiracak elektron bulamazlar. Bu durum iyon sinyalinin genliginde azalmalara neden olur. Sekildeki kirmizi ok öncül gönderilen kizil ötesi isinlari göstermektedir. UV-UV iyon azaltma yönteminde de durum farkli degildir. Burada öncül bir UV laseri ile temel seviye bolsaltilarak uyarilmis elektronik seviyeler doldurulur, böylece yine sonradan gelen iyonlastirici UV laseri temel sevyeden iyonlastiracak bir molekül bulamayacagi icin, iyon sinyali genliklerinde düsüsler gözlenir. Iyon sinyalindeki düsüsler ayni konformere ait bandlar icin ayni frekansta ortaya cikar. Özet olarak öncül gönderilen bir IR ya da UV isinlari ile resonant iyonlastirici laserin, resonant durumu bozulur, bu durum iyon sinyalinde düsüslere neden olur. Bir baska deyis ile önceden süper sonic sistemle sogutulan moleküller, kizil ötesi isinlarla tekrar sicak hale getirilir. Sicak moleküllerle soguk molekülerin rezonslari farkli frekanslarda oldugu icin, sabit iyonlasmada yikim ortaya cikar[  ]. Kizil ötesi iyon azaltma yöntemi genelde farkli bandlari siniflandirmadan öte, daha cok moleküllerin karakteristik salinim frekanslarini belirlemekte kullanilir. Yukarda sözü edilen kizil ötesi absorption frakanslari moleküllerin karakteristik gruplarinin salinim frekanslaridir. Moleküllerde vibrasyon frekanslarinin belirlenmesi ile geometrik yapilarida belirlenir. Ilk önce molekülün IR/R2PI yöntemi ile özgür durumda karakteristik vibrasyonlari ölcülür. Daha sonra moleklü cluster yapidayken yine ayni karakteristik vibrasyonu ölcülür. Cluster yapidaki karakteristik frekansta kirmiziya kayma gözlemlenirse, bu karakterisik grubun bir hidrojen köprü bagi yaptigi kararina varilir. Bu sekilde bir kromoforun hangi atomunun baska bir bir molekül ya da atomla hidrojen köprü bagi kurdugu belirlenir.

figür9: Fenol / Amoyak sisteminin temel durumda vibrasyonlari.

Figür 9, (1:1) fenol/ amonyak sisteminin 3000-3500cm^-1 dalga sayilari arasinda alinmis IR/R2PI spektrumunu göstermektedir. Burda 1 den 5'e kadar olan bandlar benzol halkasindaki c atomlarinin salinim frekansidir. Cok güclü düsüs gösteren 6'nci band fenolun bagli OH grubun frekansidir (3294cm^-1). Bu grup kuantum kimyasal hesaplamalarda H-Köprü donor olarak görülmektedir [ ]. Fenolun özgür OH salinimlari 3656cm^-1 dalga sayisindadir. Böylece bu asiri kirmiziya kayma ile Amonyagin fenolun OH grubuyla H-köprü bagi kurdugu sonucuna ulasiriz. Kesikli cizgilerle gösterilen dalga sayilari özgür amonyagin modlaridir. Normalda amonyagin ikisi υ₃=3444cm^-1 dejenere  asimetrik ve υ₁=3337cm^-1 simetrik üc modu vardir. Spektrumunda 8. ve 9. bandlar yerlerinden cok az kaymislardir ayrica iki bandin gözlenmesi asimetrik modun dejenerliginin kalktigini göstermektedir. 7'nci band hemen hemen hic yerinden kaymamistir. Bu iyon azaltma spektrumu UV iyonlastirici laseri 37512cm^-1 dalga sayisina sabitlenerek kaydedilmistir( figür 7b deki 1 bandin gecisi)

LIF-Spektroskopisi

Heinsenberg belirsizlik ilkesi geregi her uyarilmis kuantum seviyesinin belirli bir Δt=h/ΔE yasam süresi vardir. Uyarilan bir molekül, uyarildigi seviyede yasam süresince kalir ve sonunda aldigi enerjiyi ortama geri vererek kararli durumuna geri döner. Laserle uyarilan bir molekülün spontan (kendiliginden) saldigi isigin spektral kaydedilmesi teknigidir LIF ( Laser Induced Fluorescence) spektroskopisi[ ]. Bu teknikte kütle ölcümüne gerek yoktur, ayni zamanda ara seviyeler ölcüldügü icin  R2PI daki gibi fazla foton sayisina da ihtiyac yoktur (10µJ). Spektrumlar boslukta ilerleyen molekül pulsunun bir UV laseri ile taranmasi ile elde edilir. Laser kaynagindan resonant tek foton soguran moleküller bir süre sonra sogurduklari fotonla ayni frekansta, ayni polarizasyonda ama her yönde ortama foton salarak temel seyiyeye geri dönerler. Ölcümlerde ortama salinan fotonlar PM (Photo multiplier, foton cogaltici) veya bir CCD kamera ile ölcülür ve ayni R2PI da oldugu gibi ara seyiyelerin gecisler belirlenir. Spektrumlardaki bandlarin gruplandirilmasi ve molekül yapilarinin belirlenmesi IR/R2PI  ya da UV-UV iyon azaltma yöntemide oldugu gibidir. Burada iyon yerine foton sayisinda azalma gözlenir  (IR/ LIF).

figür 10: LIF ve IR/LIF tekniginde enerji semalari. a) sematik olarak LIF'in uygulanisini gösterir. Taramali bir UV laseri ile molekül (konformasyolar) S₀ temel seviyeden S₁ birinci elektronik sevyeye ya da onun vibrasyon seviyelerine uyarilirlar. Moleküller temel seviyeye dönerken isima yaparlar ( kirmizi simsekler). b de foton azaltma yöntemi gösterilmistir. Burada bir fotonlu UV uyarimi ile sabit spontan isima ölcülür. dt zaman önce molekül bir IR fotonu ile temel elektronik seviyede vibrasyonel uyarilirsa, artcil UV fotonlari temel seviyede uyarabilecek molekül bulamazlar, böylece spontan salinan foton sayisinda yikim olusur. Her foton yikimina neden olan IR frekansi molekülün belirli karakteristik gruplarinin vibrasyon frekansidir.